Die Katakombe der Heiligen Mustiola ist eine der drei Katakomben in der Toskana. Die anderen beiden sind die Katakombe der Heiligen Caterina und die Katakombe auf der Insel Pianosa, welche jedoch für die Öffentlichkeit geschlossen ist. Die der christlichen Märtyrerin Mustiola gewidmete Grabstätte liegt wenige Kilometer von Chiusi entfernt und stammt aus dem 3. Jahrhundert. Sie wurde im Zuge von Aushubarbeiten in der ersten Hälfte des 17. Jahrhunderts von einer Gruppe von Franziskanermönchen entdeckt, die mit dem Bau eines Brunnens in der Nähe ihres Klosters beschäftigt waren, das sich auf dem angrenzenden Hügel nicht weit von der Stelle, an der einst die der Heiligen Mustiola geweihte Basilika stand, befand.
Die Katakombe, die an der Straße zum See Lago di Chiusi liegt, ist an den Hängen eines Hügels in den Sandstein gehauen und besteht aus einer Reihe von Tunneln, die vom Haupteingang abzweigen; letzterer wiederum führt zu einer kleinen Basilika, einer faszinierenden Kultstätte für archaische christliche Riten.
Die zwei Hauptgänge weisen eine Reihe von Symbolen und Gravuren an den Wänden auf; bei den hiesigen Gräbern handelt es sich hauptsächlich um Grabnischen und Arkosolien, d. h. Bogennischen, die der Unterbringung von Sarkophagen dienen und für römische Katakomben typisch waren. Im Inneren des Katakombenkomplexes der Heiligen Mustiola sticht ein mehrreihiges Arkosolium, das der Aufbewahrung mehrerer Verstorbener diente, durch seine Besonderheit hervor.
Die Katakombe umfasst eine Krypta mit einem Altar und zahlreichen Inschriften, von denen eine sich auf Lucius Petronius Dextrus bezieht, den ersten Bischof von Chiusi, der in der ersten Hälfte des 4. Jahrhunderts verstarb. Die Vielzahl an Inschriften, die hier gefunden wurde, hat die Wissenschaftler zu der Annahme veranlasst, dass der Katakombenkomplex über einen Zeitraum von rund einhundertfünfzig Jahren, vom 3. bis zum frühen 5. Jahrhundert, als Grabstätte genutzt worden war.
Die Katakombe scheint der Ort zu sein, an dem die Heilige Mustiola, die heutige Schutzpatronin von Chiusi, ursprünglich bestattet wurde. Der Kult um ihre Person begann im 4. Jahrhundert und im 5. Jahrhundert wurde ihr eine Basilika gewidmet, die mehrmals zerstört und wieder aufgebaut wurde, bis man sie im Laufe des 19. Jahrhunderts endgültig abriss. Ihre sterblichen Überreste wurden in die Nebenkathedrale San Secondario überführt, wo man das Kenotaph der Heiligen bewundern kann.