L’origine della Basilica di Santa Maria all’Impruneta affonda nella leggenda. La sua fondazione si dovrebbe infatti al miracoloso ritrovamento di un’icona della Madonna. Si narra che, quando si decise di costruire un tempio in onore della Vergine, le mura che venivano innalzate di giorno si disfacevano durante la notte. Le pietre furono allora caricate su un carro e quando i buoi si fermarono e si inginocchiarono si cominciò a scavare, in quel punto venne rinvenuta la sacra immagine. Questo racconto è ripreso anche in un bassorilievo quattrocentesco attribuito a Pasquino da Montepulciano, che costituisce il prototipo iconografico di tutte le incisioni dedicate alla Vergine. La Madonna dell'Impruneta è ancora oggi al centro di un sentito culto popolare, tanto da fare della chiesa probabilmente il più antico dei Santuari Mariani d'Italia.
L’interno della chiesa, a navata unica e scandito da quattro altari in pietra serena, presenta un aspetto tardo-cinquecentesco. All’ingresso, a sinistra, vi è un’elegante acquasantiera in marmo donata nel 1542 dalla Compagnia dei Tavernieri e Cuochi di Firenze; oltrepassato il Battistero si possono ammirare, sul primo altare a sinistra, il dipinto della Vocazione di Pietro e Andrea, opera firmata da Jacopo Chimenti (1606), e sul secondo altare a sinistra Il Martirio di San Sebastiano, attribuito a Matteo Rosselli (1578-1650). Più avanti si trova il tempietto della Vergine, realizzato sul modello di quello della Santissima Annunziata, ed eseguito su disegno di Michelozzo, da Pagno di Lapo Portigiani e Maso di Bartolomeo. Le robbiane che lo ornano, di Luca della Robbia, sono finemente decorate. L’altare della Madonna presenta al centro un ciborio in argento raffigurante il Ritrovamento della Sacra Immagine.
L’altare maggiore è ornato da un Polittico che raffigura la Madonna con Bambino e Santi.
Il tempietto posto a destra dell'altare era destinato a custodire il Santissimo Sacramento: al centro del tabernacolo è rappresentata una drammatica Crocifissione opera di Luca della Robbia, fra San Giovanni Battista e un Santo Vescovo (San Romolo o San Zanobi). Nell’attiguo coretto si trova la splendida grata in bronzo dorato decorata da emblemi della Passione, eseguita nel 1636 da Cosimo Merlini il Vecchio, orafo granducale. Nella prima cappella a destra si può ammirare sull’altare un Crocifisso in bronzo attribuito a Pietro Tacca (1577-1649). Sui due altari nella parete destra della navata vi sono i dipinti La Natività della Vergine di Domenico Cresti detto il Passignano, datato 1602, e Il Martirio di San Lorenzo, attribuito a Cristofaro Allori (1577-1621).
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