La basilica collegiata di Santa Maria Assunta, ovvero il Duomo di San Gimignano, è il principale luogo di culto della città. Situata in piazza del Duomo, in cima a un'ampia scalinata, è stata costruita probabilmente nel 1056 e consacrata nel 1148, ha subito ristrutturazioni (nel 1239) e fu ampliata secondo progetto di Giuliano da Maiano nel 1460. Gli interventi successivi sono stati riparatori dei danni causati dalla seconda guerra mondiale.
La facciata spoglia in travertino è di epoca romanica e presenta un rosone centrale e due portali sormontati da una lunetta monolitica a tutto sesto con la ghiera decorata a cordone. Lo spazio interno della chiesa, a pianta basilicale, è ritmato da quattordici classiche colonne tuscaniche in pietra, di cui dieci di forma rotonda e quattro ottagonali. Le pareti della chiesa sono interamente coperte da meravigliosi affreschi che raccontano le Storie del Nuovo e del Vecchio Testamento dipinte da illustri pittori della scuola senese del XIV secolo come Lippo e Federico Memmi e Bartolo di Fredi. L'interno conserva inoltre le decorazioni policrome tipiche delle chiese medievali, come la magnifica volta a crociera dipinta di blu e gli intradossi delle arcate che separano le navate, decorate con un motivo a bande tipico del gusto toscano.
Nel Duomo è inoltre possibile ammirare un gioiello del Rinascimento: la Cappella di Santa Fina che ha visto al lavoro tre importanti artisti fiorentini: l'architetto Giuliano da Maiano, lo scultore Benedetto da Maiano e il pittore Domenico Ghirlandaio. La cappella è dedicata alla santa più cara a San Gimignano la quale, colpita in giovane età da una grave malattia, volle giacere per il resto dei suoi giorni su una tavola di legno che, al momento della sua morte, fiorì di viole gialle. Ogni anno, a marzo, le viole di santa Fina fioriscono rigogliose in mezzo alle dure pietre delle torri che costituiscono il celebre profilo della città medievale.